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产品名称:

几种致泻性结肠埃希氏菌评定生化试剂盒PCR法

厂品主要参数: 96T 货品用时: 2022-04-24
几种致泻性肠子埃希氏菌判定采血管盒PCR法可对应物品、饲料添加剂等食品的样品中的病原菌微动物的特异核酸段落实施PCR扩张,加测设备实时公交监测技术PCR扩张历程中的荧光网络信号变现,重新判读没想到。本食品采用致泻肠子埃希氏菌的加测。验出限为 103 CFU/ml。

产品概述

五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒PCR法

产品说明

五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒PCR法可应对商品、预混料等土样中的致病性微微生物发酵的特异核酸场面展开扩张,仪器设备实时路况监测方案扩张方式中的荧光信号灯变化规律,全自动判读数据。本设备应用在致泻肠道埃希氏菌的加测。验出限为 103 CFU/ml

◆    产品组成(96 测试)

222.png

 

◆   流程检测仪器

ABI ,BioRad,TaKaRa 等 PCR 增加仪,电泳仪,疑胶显像仪等电泳模块化专用设备。(使用的荧光按量 PCR 仪对其进行定性判读时则无须电泳设备)

◆   自备耗材和仪器

①灭菌方法 1.5mL 或 2.0mL 离心式管;②冰盒;③移液器(0.5-10μL,10-100μL,100-1000μL)及设备配套灭菌处理吸头;④ 抽滤机;⑤涡流混匀器;⑥黑色金属浴。

◆   样品处理

参照《GB4789.6—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》中的操作步骤进行前增菌。建议使用试剂配套细菌基因组 DNA 提取系列产品。

◆   实验操作

1.化学化学药品配置(化学化学药品配置区,平放于冰盒中实行)取掉各管免疫生化试剂,将免疫生化试剂*快速解冻,离心力 30s。取 12×(所待检备样数+3)的 PCR 反响管,按 12 个一列陈列并编号,由小到大向各管上参加 23μL 的 12 种表现液。

2.更改摸版(样例配制区,置于于冰盒中对其进行)向每管反馈液中别参加 2μL 模板(或会直接应用无菌检测吸头挑取一些待检菌落至化学反应管内)。加样范本:(有 N 个待测图纸)

取(N+3)组 12 个1组的症状管,按步骤第1组 12 管内完全引入 2μL 的 NG-DW,最后组 12管内整体申请加入 2μL的 NG-Ecoli,其次组 12 管上都是加如 2μL 的产品的样品 1 模板图片,第五组 12 管内任何建立 2μL 的印刷品 2 模版网站,…,结果组 12 管内全注入 2μL 的PG-Ecoli。

盖好 PCR 管盖后,涡旋混匀 30s,离心 1min,立即进行 PCR 扩增反应。

3.扩张响应(扩张及物品介绍区)

按过列具体条件如何设置PCR扩增发应:(如需操作荧光法使用检测工具请抉择 FAM 的通道)

PCR 配置

荧光搜集位点

37℃

10 20分钟

1 个巡环

95℃

10 半小时

1 个循环往复

95℃

30 秒

 

30 个嵌套循环

63 ℃

30 秒

72℃

90 秒

72℃

5 半小时

1 个不断循环

 

4.代谢物电泳(增加及代谢物探讨区)

称样 4. 0g 琼脂糖粉,成为至 200 mL 的 1×TAE 电泳缓存液中,积极主动混匀。施用红外光炉一直蒸汽加热至放热,到最近琼脂糖粉*融入组成清亮黑色的盐氢氧化钠溶液。待琼脂糖盐氢氧化钠溶液待冷却至 60℃右时,加盟溴化乙锭( EB )至终含量为 0.5μg/mL, 充分混匀后,轻轻倒入已放置好梳子的模具中,凝胶长度要大于 10cm,强度宜为 3mm~5mm。检查梳齿下或梳齿间可有强力泡泡,用一些性吸头关注排掉琼脂糖疑胶中的强力泡泡。当琼脂糖疑胶*初凝固化后,莞然取出发梳,小心一点将胶块和胶床倒入电泳槽中,试品孔防止在阴。向电泳槽里加入 1×TAE 电泳缓冲区液,液面高过胶面 1mm~2mm。将5μL PCR 化合物与 1μL 6×上样加载液混匀后,用轻微移液器获取混合式液铅垂伸入液面下胶孔,心上样于孔中;呈阳性對照的 PCR 反应产物加入到最后一个泳道;第1 个泳道里加入 2 μ L 氧分子量 Marker 。拨通电泳仪电源开关,要根据计数公式: 电压=电泳槽正负极极间的多远(cm)×5V/cm 运算并确定电泳仪额定电压电流值;无法额定电压电流触点开关,电泳逐渐开始以正负符号极白金和铂金丝现身泡沫时以。电泳 30min~45min 后,切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果,拍照并记录数据。

可让用 Gold view、Gal-Rad 等等等等效的核酸荧光活性染料代替 EB。

高性价比适用 DNA Marker:DL2000 或 100bp ladder,等可指的是 100bp~1500bp 条带的 Marker。

◆    结果分析

1.阴阳型判读:

完成电泳在线检测时,需相比 Marker 实行评断,当作用靶标相当于所在位置出来简单正相关条带时可评断该靶标为弱阳; 这样为该靶标测量为阴性反应。(运用荧光酶联免疫法 PCR 仪监测时,监测孔Ct≤30 时分辩该孔为阳型;当检则孔Ct>30 时, 该测试孔为假阳性)

范本电泳图

111.png


2.合理实效性判读:

需还充分满足:1.空白页照表中有泳道均为弱阳;2.弱阳性剖析中 uidA 泳道呈阳性,任意泳道假阳性;2.呈阳性参考中常有泳道呈阳性,这段时间可判别测试可行。如是无法达到出现情况,则测试无法,需按顺序测试;如按顺序后没想到仍为无法,请于本集团新技术可以支持建立联系。

3.结论判读:

在實驗管用的症状下,可不同下表开展判读: 

肠道埃希氏菌菇别

计划条带的用途组合起来

EIEC

ipaH(+)

 

 

uidA

(+/-)

EAEC

aggRastApic 中两条或两条上抗体阳性

EPEC

bfpB+/-),eae(+),stx1-)stx2(-)

STEC/EHEC

stx1stx2 中好几条什么或好几条什么上述阳型,eae(+/-),bfpB(-)

ETEC

ltstpsth 中1条或上面阳型

97%超过肠子埃希氏菌为 uidA 呈阳性,可考虑阴性化剖析中该dna查重最终结果辨别扩张功效;

当导致区分为EPEC 阳性反应时,若 bfpB 靶标为阳性反应则原因分析样品英文有效具代表性EPEC;若 bfpB 靶标为呈阴性则说明样件为非明显EPEC;

当后果鉴定为STEC/EHEC 阳型时,若 eae 靶标为阳性则说明样品含有典型EHEC;若 eae 靶标为阴性化则说明书怎么写合格品为非一般EHEC。


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